高效液相色譜法測定兔血漿中注射用納米羥基喜樹堿的濃度
關(guān)于美國branson超聲波振蕩儀應(yīng)用于高效液相法測定特定成分濃度的簡述：喜樹堿(camptothecin,CPT)是從植物喜樹的樹干、樹皮和果實中提取的一種具有抗腫瘤作用的生物堿，由于毒性大而限制其臨床應(yīng)用。10-羥基喜樹堿(10-hydroxycamptothecin,HCPT)是喜樹堿的半合成衍生物，體外和動物實驗顯示它比CPT的抗腫瘤作用強和抗瘤譜寬且毒性較低。本研究通過納米技術(shù)將HCPT納米針靜脈注射到家兔體內(nèi)，然后研究家兔血漿**濃度隨時間變化規(guī)律方面考察HCPT納米針的藥動學(xué)特性，評價其臨床應(yīng)用前景。
本實驗中，主要應(yīng)用到branson超聲波振蕩儀的實驗步驟是將家兔的血漿樣品進行處理。
由于血漿樣品中含有多種組分，要得到目標樣品，就需要先進行血漿樣品的分散、混勻，這個步驟做的效果和速度對于后續(xù)的步驟存在一定的影響，所以本步驟是實驗的不可缺少的。本實驗中應(yīng)用branson超聲振蕩的時間為5分鐘，而一般品牌做的時間大致都在15-30min,branson超聲波振蕩儀實驗效果好、實驗速度快，是超聲波振蕩儀器的優(yōu)選品牌。
[摘要]
目的：建立家兔血漿中注射用納米羥基喜樹堿含量的HPLC測定方法。方法：血漿樣品酸化后，提取分析。色譜柱C18 （10 µm， 250 mm×4.6 mm ID），流動相為 10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH4.0）-甲醇（50：50），流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長384 nm。以5.0 mg/kg劑量給大白兔耳緣靜脈推注納米羥基喜樹堿針，于不同時間點采血測定**濃度。結(jié)果：羥基喜樹堿保留時間為8.7 min，定量線形范圍為20-8000 ng/mL。血漿中羥基喜樹堿的回收率為96.92%-103.51%，日內(nèi)精密度 ≤ 7.87%，日間精密度 ≤ 11.55%。納米羥基喜樹堿注射后符合三室模型。結(jié)論：本法簡便實用，定量準確，可滿足納米羥基喜樹堿動力學(xué)研究的需要。
[關(guān)鍵詞]羥基喜樹堿；納米；高效液相色譜；血藥濃度
Determination the concentration of injected-nano-hydroxycamptothecin in plasma of rabbits by HPLC
CHEN Yu-Jun1, YI Yi-Mu2(1. Wuhan medical and health center for women and children, Hubei Wuhan, 430016;2.School of pharmacy, Tongji medical college, Huazhong university of science and technology, Hubei Wuhan,430030)
[Abstract] Objective: To establish a HPLC method for the determination of injected-nano-hydroxycamptothecin in plasma of rabbits. Methods: After acid treatment, plasma samples were injected and measured by abstraction. The Chromatographic column was C18(10 µm， 250 mm×4.6 mm ID). Methannol-10mmol/L phosphate buffer (pH4.0) (50:50) was served as mobile phase at 1.0 mL/min . Detection wavelength was 384 nm. Determination the concentration of injected-nano-hydroxycamptothecin in plasma of rabbits after iv. administration with the dosage of 5.0 mg/kg. Results: The retention time of hydroxycamptothecin was 8.7 min. A good linearity was shown in the concentration range of 20-8000 ng/mL. The recovery was between 96.92% and 103.51%. The intra-day RSD was less than 7.87% and the inter-day RSD was less than 11.55%. The concentration-time curves of injected-nano-hydroxycamptothecin mainline conformed to three-compartment model. Conclusion: This method was simple, practical and accurate. It could be applied in pharmacokinetic study of nano-hydroxycamptothecin.
[Key words] hydroxycamptothecin; nano; HPLC; drug concentration in plasma
喜樹堿(camptothecin,CPT)是從我國特有的珙垌科植物喜樹的樹千、樹皮和果實中提取的一種具有抗腫瘤作用的生物堿，但由于毒性大而限制其臨床應(yīng)用。10-羥基喜樹堿(10-hydroxycamptothecin,HCPT)是喜樹堿的半合成衍生物，體外和動物實驗顯示它比CPT的抗腫瘤作用強和抗瘤譜寬且毒性較低。
納米技術(shù)的出現(xiàn)，使保留內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的HCPT進入體內(nèi)成為可能，為充分發(fā)揮其抗腫瘤活性帶來希望。本研究將從HCPT納米針靜脈注射后在家兔血漿**濃度隨時間變化規(guī)律方面考察HCPT納米針的藥動學(xué)特性，評價其臨床應(yīng)用前景。
1 儀器、試藥與實驗動物
1．1 儀器 Lab Alliance高效液相色譜儀（包括 Lab Alliance PC3000HPLCSystem和Model 500型UV檢測器），色譜柱為Irregular-HC18柱（10 µm，Φ4.6 mm×250 mm，天津市色譜科技有限公司提供），Heraeus高速離心機（德國），LDZ5-2型低速離心機（北京醫(yī)用離心機廠），BRANSON 3510型超聲振蕩儀（美國Branson公司生產(chǎn)）。 1．2 藥品、試劑與實驗動物 HCPT內(nèi)酯標準品（批號：20020501，含量：98.6%）和HCPT注射用納米針（批號：20030501，含量：97.0%）由武漢李時珍藥業(yè)有限公司提供。甲醇和乙腈為色譜純（天津市運盛化學(xué)試劑科技有限公司），磷酸和其它試劑均為分析純（天津化學(xué)試劑三廠）。日本大耳兔，天津市動物中心提供（實驗動物質(zhì)量合格證號：WJ津?qū)崉淤|(zhì)R-A準字第001號），雌雄兼用，體重2.5~3.0 kg。
2 測定方法及條件
2．1 色譜條件：色譜柱C18 （10 µm， 250 mm×4.6 mm ID），流動相為 10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH4.0）-甲醇（50：50），流速1.0 mL/min，檢測波長384 nm，柱溫30 ℃。
2．2 血漿樣品的采集 ：實驗用家兔禁食12小時，于給藥后按設(shè)計的時間點，經(jīng)耳緣靜脈取血2 mL，置于5 mL肝素化試管，3000 r/min離心10 min，取血漿，-20 ℃冷凍保存。
2．3 血漿樣品的處理：精密量取0.5 mL血漿樣品于2 mL離心管，加85%磷酸2 µL，室溫避光環(huán)合2小時以上。環(huán)合后的樣品加乙腈1 mL，充分混勻，超聲振蕩5 min，13000 r/min離心10 min。取離心后上清液1.1 mL，置于10 mL離心管，50 ℃水浴，氮氣流吹干液體，殘渣以80 µL流動相溶解，20 µL進樣環(huán)進樣。
3 分析方法考察結(jié)果
3．1 方法專屬性
取家兔空白血漿，除不加標準品溶液外，其余按“血漿樣品處理”頂下方法處理并分析，獲得空白血漿的色譜圖，將一定濃度HCPT內(nèi)酯標準溶掖加入空白血漿中，同法操作，獲得相應(yīng)的色譜圖。血漿色譜圖中HCPT保留時間為8.7 min，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾HCPT的測定。
